Ako ste ikada sudjelovali u eksperimentu analize ponašanja životinja, znate da se događa mnogo više od pukog promatranja životinja kako rade svoje. Laboratorijski miš koji juri kroz labirint, riba zebra koja juri u akvariju - svaki sićušni detalj može uništiti vaše podatke ako niste pažljivi. Zato je kontrola varijabli okosnica solidnog istraživanja ponašanja životinja. Godinama se bavim analizom ponašanja životinja, radeći s laboratorijima i istraživačima posvuda, i budimo realni: ne radi se samo o tome da imate cool alate – radi se o utvrđivanju svake varijable, čak i onih za koje ne mislite da su važne.
Prvo, razgovarajmo o velikima koje ne možete zanemariti: biološkim varijablama. Ovo nije samo "koliko je miš star" (iako je to ogromno). Naprezanje, spol, zdravlje, čak i cirkadijalni ritam - sve to mijenja ponašanje. Jednom mi je došao istraživač u panici jer je izvedba njihove testne grupe u labirintu bila posvuda. Ispostavilo se da su pomiješali dva soja miševa: C57BL/6, koji su super bistri, i BALB/c, koji su mnogo više zabrinuti. Nije ni čudo što su podaci bili zbrkani. Dakle, prvi korak: standardizirajte svoje subjekte što je više moguće. Ako ne možete koristiti točno isti soj, spol i dob za svaku skupinu, barem ravnomjerno podijelite te varijable na kontrolne i ispitne skupine.
Cirkadijalni ritam je još jedan koji ljude sapliće. Životinje se ne ponašaju isto u 9 ujutro kao u 21 sat. Miševi su noćni život, zar ne? Ako testirate miša na kraju njihovog svjetlosnog ciklusa (kada je umoran), kretat će se mnogo sporije nego da ga testirate u tamnoj fazi. Imali smo klijente koji su prilagodili svoje rasporede testiranja kako bi odgovarali aktivnim vremenima njihovih subjekata, a njihova dosljednost podataka skočila je kroz krov. To je mala izmjena, ali čini veliku razliku.
Zatim, varijable okoline. Ovdje sama laboratorijska postavka može postati varijabla ako joj dopustite. Osvjetljenje, zvuk, temperatura, vlažnost - sve to utječe na ponašanje životinja. Vidio sam da su rezultati vodenog labirinta u laboratoriju bili iskrivljeni jer je AC puhao izravno na jednu stranu spremnika, čineći vodu tamo malo hladnijom. Miševe čak i miris parfema novog istraživača može izazvati stres i promijeniti njihovo ponašanje.
Zato uporaba namjenskih sustava kao što je naš Radial Arm Maze čini veliku razliku. Čekaj, ako to želiš provjeriti, ovdje je:Labirint radijalnog kraka. Ovaj sustav nije samo labirint—to je kontrolirano okruženje s dosljednim osvjetljenjem, razinama zvuka, pa čak i uređajima za praćenje koji bilježe svaki pokret, tako da ne morate brinuti o ljudskoj pogrešci pri brojanju ulazaka ruku. Sam labirint dizajniran je tako da vanjske smetnje svede na najmanju moguću mjeru, tako da možete biti sigurni da su sve promjene koje vidite u ponašanju rezultat vaše stvarne testne varijable, a ne sobe.
Tu su i varijable koje se odnose na način na koji izvodite sam test. Rukovatelji, protokoli testiranja, čak i redoslijed kojim testirate životinje - sve to može dovesti do pristranosti. Na primjer, ako jedan istraživač upravlja kontrolnom skupinom, a drugi ispitnom skupinom, životinje bi mogle drugačije reagirati na svaku osobu, iskrivljujući rezultate. To se zove pristranost eksperimentatora i mnogo je češća nego što ljudi misle.
Preporučamo treniranje svih ispitivača na isti način, koristeći iste tehnike rukovanja, kako životinje ne bi primijetile suptilne razlike u načinu na koji ih se hvata ili kako im se govori. Također, nasumični redoslijed testiranja—nemojte prvo raditi sve kontrolne životinje, a zatim sve testne. Pomiješajte, tako da sve male promjene u laboratoriju tijekom dana (poput prigušenja rasvjete ili uključivanja klima-uređaja) podjednako utječu na obje skupine.
Sada, idemo konkretnije s različitim vrstama testova ponašanja, jer kontrola varijable izgleda malo drugačije ovisno o tome što učite. Uzmimo, na primjer, ponašanje pruritusa (svrbež). Ako testirate kako lijek utječe na reakciju na svrbež, morate kontrolirati sve što bi moglo natjerati životinju da se ogrebe osim lijeka. Tu stupa na scenu naš Sustav za analizu ponašanja svrbeža kod životinja—provjerite ga ovdje:Sustav za analizu ponašanja pruritusa kod životinja. Ovaj sustav koristi videopraćenje kako bi točno prebrojao koliko se puta životinja počešala, a postavljen je da eliminira ometanja, tako da ne zamijenite nasumično dotjerivanje s češanjem uzrokovanim svrbežom. Također kontrolira stvari kao što je položaj životinje (sjedenje u odnosu na stajanje može promijeniti koliko će se češati), pa čak i doba dana, tako da su vaši podaci o svrabu čvrsti.
Analiza hoda još je jedno područje u kojem je kontrola varijabli kritična. Ako proučavate kako ozljeda ili lijek utječe na hod životinje, male razlike u postavljanju testa mogu učiniti da izgleda kao da se hod mijenja kada je to samo postava. Naš jednokanalni (više)kanalni sustav analize hoda visoke razlučivosti napravljen je za to—ovo je poveznica:Jednokanalni (više)kanalni sustav analize hoda visoke rezolucije. Koristi senzore tlaka i kamere velike brzine koje se kalibriraju svaki put, tako da se hod svake životinje mjeri pod identičnim uvjetima. Nema više neravnih podnih površina ili nedosljednih kutova kamere koji smetaju vašim podacima. Natjerali smo neuroznanstvene laboratorije da ovo koriste za praćenje promjena u hodu kod miševa povezanih s Parkinsonovom bolešću i rekli su nam da su podaci mnogo ponovljiviji nego s njihovim starim postavkama.
Što je sa zebricama? Vrlo su česti u istraživanjima razvoja i neuroznanosti, a testiranje njihovog vestibularnog očnog refleksa (VOR) velik je dio toga. VOR je ono što im održava vid stabilnim dok plivaju, pa ako je isključen, govori vam o unutarnjem uhu ili funkciji mozga. Kontrola varijabli ovdje znači osigurati da je spremnik savršeno miran, da je temperatura vode dosljedna i da su vizualni podražaji svaki put identični. Zato je naš sustav za testiranje vestibularnog očnog refleksa Zebrafish dizajniran za sve to—poveznica ovdje:Sustav za ispitivanje vestibularnog očnog refleksa zebrice. Kontrolira protok vode, razine svjetla i frekvenciju podražaja, tako da možete biti sigurni da su sve promjene u VOR-u uzrokovane vašim ispitanikom, a ne okolinom. Surađujemo s mnogo laboratorija za ribice zebre i oni se kunu u ovaj sustav za smanjenje varijabilnosti podataka.
I nemojmo zaboraviti slušno testiranje, poput testa slušnog odgovora moždanog debla miša (ABR). Ako proučavate gubitak sluha ili kako lijek utječe na sluh, morate biti sigurni da su zvučni podražaji potpuno isti za svaku životinju i da nema pozadinske buke koja smeta rezultatima. Naš sustav za ispitivanje slušnog odgovora moždanog debla kod miša napravljen je za to—provjerite ga ovdje:Sustav za testiranje reakcije slušnog moždanog debla miša. Koristi zvučno izolirane komore, kalibrirane zvučnike i dosljedno postavljanje elektroda, tako da su vaši ABR podaci točni i pouzdani. Istraživač s kojim sam radio prije je koristio osnovnu ABR postavu, a njihovi podaci o pragu imali su razliku od 10 decibela između životinja koja je trebala biti ista. Nakon prelaska na naš sustav ta je razlika pala na manje od 2 decibela — golemo za tumačenje promjena sluha.
Čekaj, ali čak i uz sve otmjene alate, postoji jedna varijabla koju je lako propustiti: analiza podataka. Način na koji kodirate i ocjenjujete ponašanje također može dovesti do pristranosti. Ako ručno ocjenjujete videozapis ponašanja životinja, veća je vjerojatnost da ćete računati ponašanje ako je u testnoj skupini, zar ne? Zato je upotreba automatskog praćenja (poput sustava koje nudimo) bolja, ali ako morate bodovati ručno, koristite bodovanje na slijepo. To znači da osoba koja ocjenjuje video ne zna u kojoj je skupini životinja—oni samo gledaju video i broje ponašanja ne znajući je li kontrolna ili testna. Ne mogu vam reći koliko su puta to bili popravljeni nestabilni podaci. Sve naše klijente obučavamo o bodovanju na slijepo kada postavljamo naše sustave, jer je to jednostavan korak koji čini veliku razliku.
Još jedna stvar: veličina uzorka. Mnogi istraživači ovo preskaču, ali ako je vaš uzorak premali, nasumične varijacije mogu učiniti da vaši podaci izgledaju kao pravi učinak iako to nisu. To se zove pogreška tipa I. Pomažemo klijentima da odrede pravu veličinu uzorka na temelju njihove vrste testa i varijabli, kako ne bi gubili vrijeme (i novac) na eksperimente koji nemaju dovoljno podataka da bi bili smisleni. Na primjer, ako provodite test Radial Arm Maze na miševima, možda će vam trebati 15-20 životinja po skupini da biste dobili dosljedne rezultate – premalo, a jedan miš koji je posebno nervozan može izbaciti cijelu skupinu.
Dopustite mi da podijelim kratku priču koja je ovo dovela kući. Novi klijent došao nam je prije nekoliko mjeseci, frustriran jer je njihov prethodni eksperiment s labirintom imao proturječne rezultate. Koristili su dva različita soja miševa, testirana u nasumično odabrano doba dana, i sami su ocjenjivali videozapise labirinta (znajući koji je test, a koji kontrolni). Radili smo s njima kako bismo popravili sve varijable: koristili smo samo jedan soj, testirali u isto vrijeme svaki dan (tijekom mračne faze kada su miševi aktivni), a treća strana naslijepo je ocjenjivala videozapise. Kad su ponovno proveli test s našim Radial Arm Maze, rezultati su bili kristalno jasni - nema više proturječnih podataka. Na kraju su objavili ta otkrića i rekli nam da je jedini razlog zašto prvi eksperiment nije uspio taj što nisu kontrolirali varijable. To je stvar s ponašanjem životinja: to nije raketna znanost, ali lako je dopustiti da male varijable prođu kroz pukotinu.
Dakle, da završimo ovo: kontroliranje varijabli u analizi ponašanja životinja je namjerno. Počnite sa standardizacijom svojih subjekata (soj, spol, dob, zdravlje), odredite okolinu (osvjetljenje, zvuk, temperatura), kontrolirajte način na koji izvodite test (rukovatelj, redoslijed, podražaji), koristite alate dizajnirane za precizno mjerenje i pobrinite se da vaša analiza podataka bude nepristrana. Preskočite prečace—čak i one male, poput testiranja u krivo vrijeme ili miješanja sojeva—i dobit ćete daleko pouzdanije podatke.
Ako želite pooštriti svoju kontrolu varijabli, bilo da radite testove labirinta, testove svrbeža, analizu hoda, VOR testove zebrice ili ABR miševe, imamo sustave koji vam mogu pomoći. Surađujemo s laboratorijima svih veličina, od malih akademskih timova do velikih farmaceutskih tvrtki, i tu smo da vas provedemo kroz svaki korak — od postavljanja alata do osiguravanja da vaš eksperiment bude što je moguće više kontroliran. Bez žargona, bez obruča, samo otvoreno razgovarajte o poboljšanju svojih podataka. Obratite nam se kada budete spremni podići razinu svoje analize ponašanja životinja i osigurat ćemo da vam sljedeći eksperiment da jasne, pouzdane rezultate koji su vam potrebni.
Reference:
- Garland Jr, T. i Adolph, JS (1994). Fiziološka diferencijacija genotipova kralježnjaka. Američki zoolog, 34 (1), 151-165.
- Crabbe, JC, Wahlsten, D. i Dudek, BC (1999). Genetika ponašanja miša: interakcije s laboratorijskom okolinom. Znanost, 284(5420), 1670-1672.
- Blanchard, DC i Blanchard, RJ (1988). Etoeksperimentalni pristupi biologiji emocija. Annual Review of Psychology, 39(1), 43-68.
- Metten, P., Crabbe, JC i Rhodes, JS (2005.). Što je normalno? Varijabilnost ponašanja u laboratorijskih miševa. Current Opinion in Neurobiology, 15(2), 145-150.
- Prescott, MJ i Prescott, A. (2011). Korištenje životinjskih modela u senzorskim istraživanjima. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 366(1581), 3002-3013.
