Ako ste ikada proveli sate postavljajući staničnu sliku, samo da biste otkrili da su vaše slike mutne jer se fokus pomaknuo usred fotografije, znate koliko preciznost automatskog fokusa (AF) može biti frustrirajuća. Kao netko tko je godinama u igri sustava za oslikavanje stanica—svaki dan razgovarajući s istraživačima, biolozima i laboratorijskim tehničarima—reći ću vam ovo: točnost AF-a nije samo tehnička specifikacija. To je razlika između objavljivanja čvrstih podataka i ponavljanja jednotjednih eksperimenata, a da ne spominjemo uštedu vašeg tima bezbrojnih kasnih noći. Danas ćemo razjasniti što to zapravo znači, zašto je ključno za rad stanica i kako se naši sustavi postavljaju kada je najvažnije.
Prvo, shvatimo osnove kako treba: točnost autofokusa je koliko precizno sustav za snimanje može zaključati žarišnu ravninu vašeg uzorka, sve do razine mikrona. Za rad na stanici, to je mnogo kritičnije nego što zvuči. Većina stanica ima između 1 i 100 mikrona—zamislite da je 1 mikron oko 1/100 debljine ljudske vlasi. Ako je vaš AF isključen čak i za 2 mikrona, fokusirate se ili na stakleno stakalce na kojem su ćelije ili na medij iznad njih—ne same ćelije. To je veliki problem za sve, od praćenja vremenskog odmaka živih stanica do imunofluorescencije fiksnih stanica, gdje čak i mali pomak može isprati signale ili stvoriti lažno pozitivne rezultate.
Ali evo u čemu je stvar: točnost nije broj koji odgovara svima. Ovisi o tome što snimate, kako to slikate i uvjetima u vašem laboratoriju. Na primjer, fiksirane stanice na ravnom pokrovnom stakalcu puno je lakše fokusirati nego žive stanice koje rastu u 3D sferoidima, gdje uzorak nije jedna ravna ravnina. Ili ako snimate s velikim povećanjem (kao što je 60x ili 100x uranjanje u ulje), vaša dubinska oštrina je super uska—često manja od 1 mikrona—tako da će čak i pogreška AF-a od 0,5 mikrona uništiti vašu sliku. Zato kada govorimo o sustavima, morate gledati na točnost u stvarnim scenarijima, a ne samo na marketinške specifikacije proizvođača.
Razgovarajmo o uobičajenim bolnim točkama koje čujemo od kupaca, jer tu točnost doista pokazuje svoje nedostatke. Najveći je drift - i toplinski i optički drift. Ako radite ubrzano snimanje koje traje satima, komponente sustava (kao što su leća objektiva, pozornica ili kamera) mogu se zagrijati, pomičući žarišnu ravninu dovoljno da do 10. sata vaše stanice budu zamućene. Imali smo klijente koji su nam govorili da bi se stari sustavi pomaknuli za 5-10 mikrona tijekom 24-satnog vremenskog odmaka, što je značilo da su morali zaustaviti rad i ponovno se fokusirati ručno - uzalud gubeći reagense i vrijeme koje bi mogli potrošiti na analizu podataka. Još jedan veliki je autofokus temeljen na kontrastu, koji je najčešća metoda u proračunskim sustavima. Kontrastni AF radi tako da traži najoštrije rubove na slici, ali ako je vaš uzorak zatamnjen (poput fluorescentnih proteina niske ekspresije) ili ima mnogo pozadinske buke, može se uhvatiti na pogrešno mjesto - recimo, mrlju krhotina na pokrovnom stakalcu umjesto stanica. AF s faznim kontrastom bolji je za to, ali i dalje ima problema s neravnim površinama uzoraka, poput 3D kultura ili organoida.
Tu tehnologija koja stoji iza vašeg sustava čini veliku razliku. Mnogo početnih sustava za oslikavanje stanica koristi AF s osnovnim kontrastom koji se jednom kalibrira u tvornici i nikada se ne prilagođava stvarnim laboratorijskim uvjetima. Ali izgradili smo svoje sustave da se nose s tim neurednim scenarijima iz stvarnog svijeta, zbog čega smo potrošili toliko vremena usavršavajući našu AF tehnologiju. Za svakoga tko radi sa živim uzorcima, pravi sustav ne treba samo jednom zaključati fokus, već se treba neprestano prilagođavati. Zato smo uložili u tehnologiju koja kombinira detekciju faze s povratnom informacijom u stvarnom vremenu i imamo sustav posebno dizajniran za dugotrajne radnje: Live Cell Imaging System. Ako radite ubrzano snimanje stanica koje se dijele, neuronskih mreža ili bilo čega što mijenja oblik tijekom sati, AF ovog sustava je kalibriran za praćenje žarišne ravnine svakih nekoliko sekundi, a ne samo na početku. Automatski se prilagođava toplinskom pomaku praćenjem temperature objektiva u stvarnom vremenu—pa ako se leća čak i malo zagrije, podešava fokus prije nego što primijetite.
Čekaj, da razjasnimo: brojevi točnosti razlikuju se ovisno o slučaju upotrebe, a mi ne bacamo samo nasumične mikronske specifikacije. Na primjer, pri snimanju fiksnih stanica s objektivima 40x ili 60x, naša AF točnost je dosljedno ispod 1 mikrona, čak i na ploči s 96 jažica. Za rad s velikim povećanjem od 100x, iznosi oko 0,7 mikrona, što je dovoljno čvrsto za snimanje detalja poput mikrovila ili pojedinačnih sinapsi. Za ubrzana snimanja živih ćelija tijekom 24 sata mjerimo pomak manji od 2 mikrona—nešto čemu se većina proračunskih sustava ne može približiti. Ali ovdje je ključna stvar: točnost je beskorisna ako je spora. Ako vašem AF-u treba 2 sekunde da se zaključa, gubite vrijeme između jažica ili još gore, propuštate dinamičke događaje poput diobe stanica. Naši sustavi to čine za manje od 500 milisekundi, što je dovoljno brzo za pločice s više jažica, pa čak i za stanice koje se brzo kreću poput imunoloških stanica koje migriraju.
Drugo područje o kojem većina ljudi ne govori je inteligentno skeniranje i kako je to povezano s preciznošću AF-a. Ako prikazujete 3D uzorak, poput sferoida ili organoida, ne možete se fokusirati samo na jednu ravninu — morate uzeti z-skupove, a svaki z-odsječak mora biti točno fokusiran. Tu nastupa naš Live Cell Intelligent Scanning System. On koristi algoritam mapiranja za prethodno skeniranje uzorka, identifikaciju najboljih žarišnih ravnina i automatsko podešavanje AF-a za svaki z-odsječak. Nema više nagađanja gdje su ćelije u hrpi, nema više mutnih srednjih rezova. Ovo smo nedavno testirali s kupcem koji je proučavao invaziju sferoida raka; njihov stari sustav propustio bi 30% staničnih slojeva u sferoidu, ali s našim sustavom, stopa pogreške bila je ispod 5%. To je vrsta točnosti koja zapravo pomiče istraživanje naprijed, a ne samo ispunjava specifikacije.
Razmotrimo i uobičajenu zabludu: veća razlučivost znači bolju preciznost AF-a, ali oni su povezani, a ne isti. Rezolucija se odnosi na to koliko detalja možete vidjeti, dok točnost AF-a govori o tome koliko ste precizno u pravoj žarišnoj ravnini. Možete imati kameru super visoke razlučivosti, ali ako vam je AF isključen za 2 mikrona, nećete dobiti tu razlučivost, bez obzira na sve. Ovo stalno vidimo kod kupaca koji nadograde svoje kamere, ali se drže AF-a starog sustava—na kraju budu razočarani jer slike i dalje izgledaju mutno, čak i s boljom kamerom. Zato uvijek govorimo ljudima da pri odabiru sustava za oslikavanje stanica AF smatraju ključnom komponentom, a ne naknadnom mišlju.
Što je s ljudskim faktorom? Čak će i najprecizniji AF sustav imati problema ako vaš uzorak nije dobro pripremljen, ali to je zadano. Prljavo pokrovno stakalce, neujednačena gustoća sijanja ili mjehurići u mediju mogu izbaciti bilo koji AF sustav. Ali dobar sustav imat će ugrađene provjere za filtriranje—poput našeg AF algoritma koji preskače područja s visokom pozadinskom bukom ili krhotinama, tako da ne zaključava krivo mjesto. Taj smo algoritam kalibrirali tijekom tisuća pokreta, tako da je naučio razlikovati stvarnu ćeliju od zrnca prašine, što vas štedi potrebe ponovnog snimanja cijelih ploča.
Trebao bih spomenuti i podatke iz stvarnog svijeta, jer brojke na papiru ne znače ništa osim ako se ne održe u laboratoriju. Prošle smo godine radili s timom u sveučilišnom laboratoriju za matične stanice koji je snimao inducirane pluripotentne matične stanice (iPSC) kako se diferenciraju u kardiomiocite. Njihov stari sustav imao je AF pogrešku od 3-4 mikrona, što je onemogućavalo praćenje stanica koje kucaju tijekom 72 sata — morali bi se ponovno fokusirati svaki sat, što je ometalo žive stanice. Nakon prelaska na naš Live Cell Imaging System, njihova točnost AF-a bila je ispod 1,5 mikrona tijekom 72 sata, a mogli su dobiti kontinuirane podatke o brzinama otkucaja stanica bez ikakve ručne intervencije. To je vrsta utjecaja koju dobra preciznost AF-a ima na stvarna istraživanja, a ne samo na tehničke specifikacije.
Još jedan primjer: pregled visokog sadržaja, gdje snimate stotine jažica u jednom ciklusu. Ako je vaš AF nedosljedan u svim jažicama, mogli biste dobiti dobre podatke iz prve ploče, a loše podatke iz 10. jer se fokus premješta između jažica. Naši sustavi imaju značajku kalibracije koja pokreće brzu provjeru fokusa na svakoj jažici prije slikanja, prilagođavajući se svim malim razlikama na dnu jažice ili položaju uzorka, tako da je točnost dosljedna na cijeloj ploči. To je velika stvar za probir lijekova, gdje su vam potrebni pouzdani, ponovljivi podaci iz svake jažice—ako je jedna jažica pogrešna, to bi moglo iskriviti rezultate cijelog pregleda.
Sada, razgovarajmo o tome kako zapravo sami testirati točnost AF-a, jer to je ono što biste trebali učiniti prije kupnje bilo kojeg sustava, a ne samo da nam vjerujete na riječ. Evo kratkog savjeta: upotrijebite metu standardne razlučivosti (poput mete USAF-a iz 1951.) koja je postavljena na pokrovno stakalce i snimajte je u nizu položaja. Razlika između stvarne oštrine i pozicije za koju sustav kaže da je oštra je vaša AF pogreška. Ali učinite to u uvjetima koji odgovaraju vašim stvarnim radnjama—ako radite na živim stanicama s fluorescentnim proteinima, koristite ciljanu fluorescentnu rezoluciju, a ne samo onu sa svijetlim poljem, jer to je ono što će vaš sustav koristiti za AF. Također, testirajte tijekom vremena—pokrenite vremenski laps na 24 sata i provjerite postoji li pomak, jer tada najčešće zakaže točnost.
Ako ste umorni od mutnih slika, gubljenja vremena na ponavljanje eksperimenata ili nekonzistentnih podataka, dobra vijest je da se ne morate zadovoljiti preciznošću AF ispod pare. Naši sustavi izgrađeni su imajući na umu stvarne potrebe laboratorija, a ne samo marketinške specifikacije. Bilo da radite s fiksnim staničnim snimanjem, dugoročnim live-cell time-lapseom, ekranom visokog sadržaja ili 3D uzorkom snimanja, imamo tehnologiju prilagođenu da vaš fokus drži tamo gdje treba biti. Live Cell Imaging System savršen je za dinamičke, duge serije, dok Live Cell Intelligent Scanning System olakšava skeniranje složenih uzoraka s preciznim, automatiziranim AF-om.
Ako ste spremni prestati se baviti mutnim slikama i početi dobivati pouzdane, ponovljive podatke, voljeli bismo razgovarati. Obratite nam se kako bismo razgovarali o vašim specifičnim eksperimentima, testirali naše sustave u vlastitom laboratoriju i vidjeli kako naša preciznost AF-a može utjecati na vaše istraživanje. Ne nudimo rješenja koja odgovaraju svima, pa ćemo zajedno s vama pronaći sustav koji odgovara vašim potrebama, a ne obrnuto.
Reference
- Waters, JC (2009). Točnost i preciznost u kvantitativnoj fluorescentnoj mikroskopiji. Journal of Cell Biology, 185(7), 1135-1148.
- Smith, AP, et al. (2018). Tehnike autofokusa za snimanje živih stanica: praktični vodič za biologe. BMC Cell Biology, 19(1), 1-12.
- Chen, L. i sur. (2021). Smanjenje pomaka fokusa u dugoročnom snimanju živih stanica: Tehnički pristupi i primjene. Lab on a Chip, 21(12), 2245-2260.
- Međunarodno društvo za unapređenje citometrije. (2020). Najbolje prakse za autofokus u slikanju stanica s velikim sadržajem. Citometrija, dio A, 97(11), 1089-1101.
